還在糾結(jié)“單拷貝克隆產(chǎn)量低,高拷貝克隆穩(wěn)定性差”這個問題嗎?現(xiàn)在只需一支誘導(dǎo)劑就可人為控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)啦!
首先安利一下Epicentre的專利技術(shù)——CopyControl?克隆系統(tǒng),能夠讓您共享單拷貝和高拷貝的優(yōu)點。CopyControl?克隆:首先以單拷貝形式生長,單拷貝可以確保插入穩(wěn)定及成功克隆編碼基因序列;在需要的時候,通過誘導(dǎo)液誘導(dǎo)成高拷貝克隆,以便下游應(yīng)用所需。這一系統(tǒng)可以用來構(gòu)建PCR克隆,對于BAC,F(xiàn)osmid文庫等大型質(zhì)粒格外有用。
CopyControl?克隆系統(tǒng)有兩個重要成分,相輔相成,缺一不可:
1.CopyControl? pCC1和pCC2載體
pCC1和pCC2載體含有兩個復(fù)制起始位點:單拷貝的大腸桿菌F-因子復(fù)制子和誘導(dǎo)型的高拷貝oriV。其中OriV的啟動,需要trfA基因產(chǎn)物,由CopyControl?的另一個重要成分——TransforMax? EPI300 E.coli菌株提供。
圖1 pCC1載體圖譜
2.TransforMax? EPI300 E.coli
這是一種工程菌株,含有受誘導(dǎo)啟動子控制的trfA基因,在誘導(dǎo)的條件下可以提供啟動oriV所需要的trfA基因產(chǎn)物。
圖2 TransforMax? EPI300 E.coli菌株基因型
CopyControl?克隆誘導(dǎo)步驟
1、將目標(biāo)DNA片斷連接到已經(jīng)線性化、去磷酸化的CopyControl? pCC1 Vector上。
2、轉(zhuǎn)化TransforMax? EPI300 E.coli感受態(tài)細(xì)胞,涂皿,在氯霉素LB培養(yǎng)基上篩選。(在這種條件下,trfA基因的表達(dá)被抑制,克隆以單拷貝數(shù)量生長。)
3、挑選單克隆,進(jìn)行培養(yǎng)。
4、加CopyControl? Induction solution到管中,誘導(dǎo)TransforMax? EPI300宿主細(xì)胞內(nèi)trfA基因的表達(dá),從而啟動oriV,克隆由單拷貝轉(zhuǎn)化為高拷貝。
5、用常規(guī)方法從誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)分離DNA。
圖3 CopyControl?克隆流程
相關(guān)產(chǎn)品信息
美國Lucigen公司成立于1998年,提供各類用于分子生物學(xué)相關(guān)產(chǎn)品,可以使研究者成功克隆較難克隆的基因,其在2016年收購了Illumina旗下Epicentre產(chǎn)品線。目前產(chǎn)品類別主要包括:體外轉(zhuǎn)錄、基因克?。˙AC克隆試劑盒)、感受態(tài)細(xì)胞(TG1噬菌體文庫構(gòu)建感受態(tài))、體外擴(kuò)增、轉(zhuǎn)座子突變、蛋白表達(dá)、文庫構(gòu)建等。
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